IMPLANTE HOMÓGENO DE MATRIZ DENTINÁRIA CONSERVADA EM GLICERINA A 98%. ESTUDO MICROSCÓPICO EM TECIDO
CONJUNTIVO SUBCUTÂNEO DE RATO

DEMINERALIZED HOMOGENOUS DENTIN MATRIX PRESERVED IN GLYCEROL
98 % IMPLANTED IN SUBCUTANEOUS TISSUE.
MICROSCOPIC STUDY IN RATS

Tetuo OKAMOTO *
Karina Helga Leal TÚRCIO **
Tatiana Yumi YOSHINO **
Idelmo Rangel GARCIA JÚNIOR ***
Célia Tomiko Matida Hamata SAITO ****
Fábio Yoshio TANAKA *****

Os enxertos e implantes são comumente realizados com o objetivo de prevenir ou corrigir defeitos ósseos crâneo-faciais melhorando as condições morfofuncionais deste tecido. Os defeitos ósseos ocasionados por traumas, neoplasias ou infecções geralmente não reparam espontaneamente e quando isso ocorre, nem sempre reproduzem-se totalmente a forma e a função da maxila ou mandíbula.
Por outro lado, as lacunas decorrentes de amplas ostectomias no esqueleto facial necessitam de enxertos ou implantes para estabilizar os segmentos8 14.
Sob o ponto de vista da aceitação biológica, em função da superior compatibilidade tecidual, o melhor material de enxerto ou transplante é o autógeno. Entretanto, quando são utilizados enxertos autógenos, existe a necessidade de ato cirúrgico adicional para a remoção do material, criando uma ferida cirúrgica cujo pós-operatório pode ser, sob o ponto de vista clínico, mais desconfortável para o paciente do que a intervenção cirúrgica para a correção da deformidade8,10,13,16. por outro lado, nos enxertos homógenos, além da obtenção do enxerto, há necessidade de meios para sua conservação. Desta forma, bancos de enxertos são criados para viabilizar meios de conservação que venham facilitar o uso de tecidos em condições de serem utilizados como implantes biológicos.

Essas dificuldades, no entanto, não devem impedir a utilização de enxerfos autógenos ou homógenos, quando a sua aplicação estiver indicada.
Com o advento de novas técnicas, principalmente de regeneração guiada em Periodontia e Implantodontia, em que pequenas partículas de material são necessárias, voltou a crescer o interesse pela utilização de materiais aloplásticos e enxertos ou implantes homógenos e heterógenos, que permitem a sua utilização sob anestesia local17.
O objetivo de obter material de implante ou enxerto de origem autógena, homógena ou heterógena que ofereça possibilidade de conservação sem perda da viabilidade, tem levado os pesquisadores a estudarem um número elevado de substâncias.
A matriz dentinária obtida por meio de processo rápido de desmineralização foi avaliada após implante em tecido muscular de ratosl. Estudos experimentais empregando bovinos, macacos e cães foram realizados para avaliar o poder osteoindutor da matriz dentinária2.
Após processo de desmineralização as matrizes dentinária ou óssea são constituídas de proteínas morfogenéticas que induzem a diferenciação de células mesenquimais em condroblastos e tecido ósseo3,5,19. Estes estudos preconizam a desmineralização e posterior congelamento ou liofilização precedendo o implante.
Por outro lado, dentre os meios químicos de conservação, a glicerina tem oferecido bons resultados por preservar a integridade celular mesmo provocando a desidratação tecidual. Assim é que tecidos como dura-mater, córneas e cartilagem, são mantidos em glicerina para posterior utilização como implante. Estudos tem demonstrado que, além de bactericida de largo espectro, a glicerina reduz as propriedades imunológicas dos tecidos implantados12.
Diante das propriedades osteo-indutoras da matriz dentinária e da comprovada qualidade da glicerina a 98% como meio de conservação de tecidos, abrem-se perspectivas de novos estudos sobre material de implantes, justificando-se a realização deste trabalho em ratos tendo como leito receptor o tecido conjuntivo subcutâneo.
Assim, é propósito deste trabalho avaliar por meio de cortes histológicos o resultado do implante da matriz dentinária conservada em glicerina a 98% em tecido conjuntivo subcutâneo de rato.

*Ração Ativada Produtor, Anderson & Clayton S.A. " Laboratório Abott do Brasil Ltda.

Para o presente trabalho foram empregados 16 ratos (Rattus noruegicus albinus, Wistar) machos, com peso variando entre 150 e 200 gramas, dos quais 4 (quatro) foram destinados ao fornecimento da matriz dentinária a ser utilizada no projeto.
Os demais ( 12 ratos) receberam implantes da matriz dentinária e foram mantidos durante todo e período experimental com ração comercial balanceada*.
Obtenção da matriz dentinária
Para a obtenção da matriz dentinária foram extraídos os 4 (quatro) primeiros molares (2 superiores e 2 inferiores), removendo-se imediatamente a polpa radicular da raiz mesial por via retrógrada e os remanescentes do ligamento periodontal da superfície do cemento. A seguir, os dentes foram imersos em solução 0,4 Mol de ácido clorídrico à temperatura de 5°C a 10°C durante 4 a 5 dias com trocas da solução a cada 24 horas22. Após a desmineralização, foi retirada a raiz mesial, seccionando-se na altura da porção inferior da coroa dental que foi desprezada juntamente com as demais raízes. As raízes mesiais obtidas foram seccionadas transversalmente, com lâmina de bisturi, obtendo-se fatias com, aproximadamente, 2mm de espessura. A seguir, foram seccionadas novamente para possibilitar a obtenção de partículas de matriz dentinária com, aproximadamente, 2mm de diâmetro. Estas foram lavadas em água destilada, sob constante agitação, para a remoção do ácido clorídrico residual. A seguir as partículas foram colocadas em um recipiente estéril contendv glicerina a 98%, na qual foram mantidas durante 20 dias para posterior implante.


Procedimentos cirúrgicos para a implantaçãq da matriz dentinária

Após a anestesia geral com injeção intraperitoneal de tionembutal sódico
* * nos 12 animais, foi realizada a depilação na região dorsa superior e antissepsia com solução d polivinilpirrolidona (PVP-I) a
1 %. A seguir, foi realizada uma incisão linear de, aproximadamente, lcm de extensão com lâmina de bisturi n° 15. A divulsão no nível do tecido conjuntivo subcutâneo de ambos os lados da incisão foi realizada com tesoura romba. Em ambos os lados da incisão foi implantada, no espaço subcutâneo, a partícula de matriz dentinária conservada em glicerina.
Após a recolocação do retalho em posição, foi realizada a sutura interrompida com fio de poliglactina 4-0.***


Obtenção das peças para estudo histomorfológico

Decorridos 10, 20, 30 e 60 dias após o ato cirúrgico, os animais em número de 3 para cada período foram sacrificados e as peças contendo o implante, removidas e fixadas em formalina a 10%. Após processamento laboratorial de rotina, as peças foram incluídas em parafina para possibilitar a microtomia. Os cortes semi-seriados com 6 micrometros de espessura foram corados pela hematoxilina e eosina para análise microscópica.

10 Dias
"' ETHICON, Johnson & Johnson.
Decorridos 10 dias, o implante de matriz dentinária permanece no leito receptor, apresentando diferentes características. Assim, em algumas espécimes, o material permanecia na íntegra e em outros apresentava pequenas áreas de reabsorção notando-se, nas proximidades, numerosos macrófagos. Junto à superfície da matriz sem reabsorção, nota-se moderada faixa de tecido cartilaginoso exibindo numerosas células com características de condrócitos (Fig. 1 ). Err. alguns pontos este tecido sofre degeneração sendo substituído por pequenas espículas ósseas neoformadas (Fig.2). O tecido conjuntivo nas proximidades é rico em fibras colágenas.

Figura.1 - 10 dias. SuperGcie dentinária com pequena reabsorção (seta) e mostrando tecido cartilaginoso (seta) em contato com as bordas do material. HE. Original, 160x.

Figura 2 - 10 dias. Áreas com degeneração dos condrócitos e substituição por pequenas espículas ósseas neoformadas (setas). HE. Original, 160x.

20 Dias

Após 20 dias, todos os espécimes mostravam áreas de reabsorção da matriz dentinária mais pronunciadas que aquelas observadas no estágio anterior (Fig. 3 e 4). Algumas células multinucleadas podiam ser evidenciadas na área .
de reabsorção e o tecido conjuntivo nas proximidades era bem vascularizado e rico em fibroblastos. Pequenas trabéculas ósseas neoformadas podiam ser observadasjunto ao material de implante (Fig.3 e 4) notando-se nas adjacências, células com características de osteoblastos.

Figura 3 - 20 dias. Áreas de reabsorção da matriz dentinária (seta) e presença de pequenas trabéculas ósseas neoformadas (seta). HE. Original, 160x.

Figura 4 - 20 dias. Áreas de reabsorção da matriz dentinária (seta) e presença de pequenas trabéculas ósseas neoformadas (seta). HE. Original, 160x.

30 Dias

Decorridos 30 dias, a matriz dentinária sobre reabsorção apresentava-se mais intensa que aquela observada no estágio anterior. Entretanto, boa parte do implante encontrava-se presente em quase todos os espécimes. Por outro lado, notava-se maior quantidade de tecido ósseo neoformado que geralmente encontrava-se em contato com a superfície dentinária. Observavam-se, ainda, áreas de reabsorção com presença de algumas células multinucleadas.

60 Dias

60 dias após o ato cirúrgico, o material achava-se parcialmente reabsorvido. Quando comparado ao estágio anterior, a reabsorção era mais pronunciada e as áreas reabsorvidas achavamse substituídas por trabéculas ósseas neoformadas (Fig.5 e 6). Nas bordas destas trabéculas ósseas, evidenciavam-se células com características de osteoblastos (Fig.5) e a presença de tecido conjuntivo bem vascularizado e pouco organizado.

Figura 5 - 60 dias. Reabsorção mais pronunciada da matriz dentinária substituída por trabéculas ósseas neoformadas mostrando células com características de osteoblastos (seta). HE. Original, 160x.

Figura 6 - 60 dias. Área de reabsorção da matriz dentinária substituída por trabéculas ósseas neoformadas. HE. Original, 160x.

Foi estudado no presente trabalho, o implante de matriz dentinária desmineralizada conservada em glicerina a 98% no nível do tecido conjuntivo subcutâneo de rato.
O tecido conjuntivo subcutâneo é uma área considerada como adequada quando se pretende avaliar a reação do organismo a diferentes materiais. No presente estudo, foi realizado o implante da matriz dentinária com o objetivo de comprovar a possível atividade osteoindutora do material em estudo. Por outro lado, a glicerina a 98% foi utilizado como conservante tecidual por mostrar-se eficaz e adequada no tratamento de matriz óssea, córnea, dura-mater, cartilagem e outros, sem comprometer a integridade e a textura dos tecidos 4·6,9.12,15,21.
Quanto ao processo de obtenção da matriz dentinária utilizado neste estudo, baseou-se no ciclo de descalcificação por meio de HCl a 0,4 Mol por um período de 72 horas a uma temperatura de 5 a 10° graus centígrados6. Os processos mais utilizados para obtenção e conservação da matriz óssea são a descalcificação, e a liofilização com posterior congelamento7,11.


Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que, inicialmente, ocorre a formação de tecido cartilaginoso na superfície da matriz dentinária desmineralizada. A seguir, os condroblastos ou condrócitos sofrem processo de degeneração e os espaços originados são, posteriormente, ocupados por tecido conjuntivo e tecido ósseo neoformados respectivamente. Simultaneamente ocorre a reabsorção parcial da matriz dentinária, cujos espaços são, progressivamente, preenchidos também por tecido ósseo neoformado.
Assim, todas as características observadas neste estudo indicam que houve junto ao implante de matriz dentinária, o processo de osteoindução.
Ao que tudo indica, a matriz dentinária desmineralizada deve apresentar, estruturalmente, as mesmas características da matriz óssea desmineralizada. Desta forma, após o processo de descalcificação, a dentina perde quase a totalidade da parte mineral, permanecendo a sua parte orgânica composta de glicoproteínas, proteoglicanas e colágenos6,18.
A presença destas proteínas em concentrações adequadas no nível do tecido conjuntivo subcutâneo estimula o organismo a iniciar o processo de neoformação óssea, como resultado de uma série de interações entre fatores de crescimento sistêmicos e locais, componentes hormonais e protéicos e neurotransmissores, o qual termina com a deposição de minerais como cálcio e fosfato6,20,23.
Estas proteínas foram identificadas em matriz óssea desmineralizada e os estudos demonstram a capacidade das mesmas em induzir a diferenciação de células mesenquimais, gerando uma resposta osteoindutora. Foram reconhecidas muitos tipos de proteínas osteoindutoras e a proteína morfogenética óssea é apenás uma delas. Todas estas proteínas podem ativar as células precursoras ou totipotentes que têm capacidade de se diferenciar em osteoblastos.

Dentro das condições estabelecidas no presente trabalho, é possível concluir que a matriz dentinária desmineralizada, quando implantada no nível do tecido conjuntivo subcutâneo de rato, comportou-se como material osteoindutor.

* Professor Titular da Disciplina de Cirurgia do Curso de Ciências Odontológicas da UNIMAR, Marília - SP. Brasil.
** Ex-Bolsista de Iniciação Científica do PIBIC/CNPq/UNESP.
*** Professor Assistente do Departamento de Cirurgia e Clínica Integrada da Faculdade de Odontologia da UNESP. Araçatuba - SP. Brasil.
**** Estagiária do Centro de Pesquisa em Cirurgia Experimental, Faculdade de Odontologia da UNESP, Araçatuba - SP, Brasil.
***** Docente da Disciplina de Cirurgia do Curso de Ciências Odontológicas da UNIMAR. Marília - SP. Brasil. Endereço: Rua Francisco Braga. 335 - CEP 16.015-560 - Araçatuba - SP, Brasil. Fone (018) 623-5451 .